黄瓜NRT3基因的鉴定和特征分析

发布日期：2019-08-15     浏览人数：584

（山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心，济南 250100）

  摘  要：旨在探讨黄瓜NRT3基因的遗传进化和功能，为进一步研究黄瓜NRT3基因的功能提供依据。利用生物信息学方法，从黄瓜基因组中鉴定出2个NRT3基因，并对这些基因的基因组分布、结构、遗传进化和顺式元件进行了系统分析。结果显示，黄瓜的NRT3两个基因均位于1号染色体，具有1个或者2个外显子，分别与拟南芥的NRT3.1或者NRT3.2直系同源。NRT3在瓜类作物间编码蛋白的序列非常保守，它们都具有数个植物激素和逆境应答元件，而且黄瓜和甜瓜的直系同源NRT3基因的顺式调控元件存在较大差异。本研究为进一步研究黄瓜NRT3的遗传进化和功能提供了线索。
  关键词：黄瓜；硝态氮转运蛋白2；分子特征；系统进化；顺式元件
  中图分类号：S642.2 文献标志码：A 论文编号：casb16030225
Identification and Characterization of NRT3 Genes from cucumber
Sun Jianlei, Dong Yumei, Wang Chongqi, Xiao Shouhua, Li Libin, Jiao Zigao
(Institute of Vegetables and Flowers, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center, Jinan Shandong 250100)
Abstract: The aims were to explore the genetic evolution and function of cucumber NRT3 genes，and provide the evidence for further studies of cucumber NRT3 gene. Two cucumber NRT3 genes were identified by bioinformatics method, and their genome distribution, gene structure, phylogeny, and cis-elements were systematically investigated. The results showed that, two cucumber NRT3 genes both locate in chromosome 1, and they have one or two exons，they are orthologous to Arabidopsis NRT3.1 or NRT3.2 respectively. The putative NRT3 protein sequences of cucurbit crops are very conserved. And also they have several putative cis-elements responsive to plant hormones and environmental stresses. The cis-elements of cucumber and melon orthologous NRT3 genes are somewhat different. This study provided a clue for further investigate the function and evolution of the cucumber NRT3 genes.
Key words: cucumber; NRT2; molecular feature; phylogeny; Cis-element
  基金项目：山东省农业科学院青年科研基金项目“低温胁迫下黄瓜NRT家族基因的表达调控研究”(2015YQN29)；山东省农业良种工程项目“设施蔬菜新品种选育”(2014-03-07)。
  第一作者简介：孙建磊，女，1983年出生，助理研究员，博士，主要从事瓜类遗传育种和分子生物学研究。通信地址：250100 山东省济南市历城区工业北路202号 山东省农业科院蔬菜花卉研究所，Tel：0531-83175121，E-mail：sunjianlei06@hotmail.com。
  通讯作者：李利斌，男，1971年生，山东禹城人，副研究员，博士，主要从事黄瓜遗传育种和分子生物学研究。通信地址：250100 山东省济南市历城区工业北路202号 山东省农业科院蔬菜花卉研究所，Tel：0531-83179184，E-mail：libin224@126.com；焦自高，男，1963年生，山东日照人，研究员，硕士，主要从事瓜类遗传育种研究。E-mail：zigaojiao5@163.com。
引言
  氮素是植物必需的大量元素之一，对作物生长起着非常重要的作用，合理施用氮肥不仅能提高农产品的产量，还能提农产品的品质[1-2]。土壤中存在各种形态氮源，如无机氮（NO3-、NH4+等）和有机氮（尿素和氨基酸等），其中，硝态氮(NO3-)是植物利用土壤中氮素的主要形态。因此，阐明植物硝态氮的吸收转运机制，对提高作物氮素吸收利用效率具有重要意义。植物对硝态氮的吸收主要是通过植物硝态氮转运蛋白进行的[3-4]。植物的硝态氮转运蛋白主要分为低亲和性和高亲和性两种[5]。NRT又分为NRT1、NRT2和NRT3三个亚家族[6]。在拟南芥中，NRT1家族为低亲和性转运蛋白，共有16个成员，NRT2为高亲和转运蛋白，共有7个成员，NRT3中有2个成员，AtNRT3.1和AtNRT3.2，但是它们本身不具备转运能力，只能通过调控NRT2基因发挥作用[7-8]。Orsel等对拟南芥atnar2.1(AtNRT3.1)突变体研究表明，atnar2.1调控NRT2.1氮素转运过程中具有明显作用[9]。NRT家族基因在氮素吸收转运中具有重要功能[10]，不同成员具有的功能差异很大。例如，NRT1.4影响拟南芥叶柄中硝态氮的含量和叶片发育[11]，NRT1.8影响硝态氮从木质部的转移和重金属镉胁迫的抗性[12]，NRT1.9对韧皮部中硝态氮的转运至关重要[13]，NRT2.1在应答乙烯介导的缺氮应答和应答丁香假单胞菌中具有一定功能[14-15]，NRT2.4在氮饥饿植株根和茎中具有双重功能[16]，NRT2.5在氮素获取和再分配中具有重要功能[17]，NRT2.6连接生物胁迫和非生物胁迫反应[18]，NRT2.7控制种子中硝态氮的含量[19]。目前在大麦、水稻、杨树等多个植物物种中克隆了编码NO3-转运蛋白NRT的基因[20]。
  黄瓜是中国主要设施栽培蔬菜之一，在蔬菜生产中具有重要地位。开展对黄瓜氮素吸收机理的研究，不仅有助于合理施肥，提高黄瓜氮肥利用效率，而且可减少对土壤环境污染。国内外学者对拟南芥NRT基因家族的功能进行了深入的研究，但是黄瓜中有关NRT的研究很少。姚等[21]发现在亚适宜温光条件四个NRT基因和一个AMT表达与植株中氮素含量变化相关，秦智伟等克隆了黄瓜的NRT1.5基因，并对其基因表达进行了分析[22]，Migocka等对NRT1家族基因序列特征、组织器官表达特异性、系统进化及与拟南芥、水稻等NRT1基因在结构和数量上的差异进行了分析[23]，但是目前有关黄瓜NRT3的研究缺乏报道。本文利用生物信息学的方法鉴定出2个黄瓜NRT3基因，并对它们的分子结构特征、遗传进化和顺式调控元件进行了系统分析，为将来研究黄瓜NRT3基因的功能提供线索。
  1 材料与方法
  用已鉴定的拟南芥NRT3基因序列搜索黄瓜基因组数据库(http://cucumber.genomics.org.cn/page /cucumber/blast.jsp)和NCBI数据库，寻找黄瓜的NRT3基因，利用NCBI数据库，寻找甜瓜、西瓜的NRT3基因。在拟南芥数据库TAIR中利用blastp进行序列比对，确定黄瓜NRT3基因与拟南芥NRT3基因的关系。并根据编码区序列信息对其进行染色体定位。利用Mega4.1对黄瓜、甜瓜、西瓜NRT3基因进行系统进化分析。利用DNAman分别对黄瓜、甜瓜和西瓜NRT3.1，NRT3.1的蛋白序列进行比对。
  通过NRT3编码区和基因组序列的比对来显示基因外显子和内含子的结构组成，得到各个NRT3基因起始密码子ATG上游1500bp的启动子区及上游序列。顺式元件预测采用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcareplantcare/html/)进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLFPSORT (http://wolfpsort.org/)中进行。
  2  结果与分析
  2.1  黄瓜NRT3的鉴定、特征和进化分析
  利用生物信息学的方法，通过对黄瓜基因组数据库和NCBI数据库黄瓜基因的挖掘和分析，鉴定出2个黄瓜NRT3基因，分别是Csa003832和Csa003716（表1）。这2个基因都位于黄瓜的1号染色体上，其中Csa003832的编码区为636 bp，而Csa003716的编码区为1019 bp，通过对基因结构分析表明，它们分别含有2个和1个外显子（见图1）。亚细胞定位预测结果显示Csa003832定位于细胞膜上，Csa003716定位于叶绿体基质或者细胞质。对与黄瓜亲缘关系较近的甜瓜而言，也有两个NRT3基因CmNRT3.1和CmNRT3.2，都位于12号染色体上，编码区大小分别为642 bp和1020 bp，外显子分别为2个和1个。通过对黄瓜NRT3基因遗传进化分析及不同物种间同源序列比对显示，Csa003832与拟南芥的NRT3.1、甜瓜的CmNRT3.1(MELO3C002305T1)、西瓜的Cla005121直系同源，Csa003716与拟南芥的NRT3.2、甜瓜的CmNRT3.2(MELO3C002306T1)和西瓜的Cla005122直系同源（图2）。从进化上来看，黄瓜与甜瓜的NRT3关系最近，而与相对西瓜较远（图2）。从编码蛋白序列来看，黄瓜、西瓜NRT3比较保守，序列一致性达90%以上（图3和图4）。

表1  黄瓜NRT3的基因组分布及分子特征

表1  黄瓜NRT3的基因组分布及分子特征

图2  黄瓜、甜瓜、西瓜NRT3基因与拟南芥NRT3的进化分析

图3  黄瓜、甜瓜和西瓜NRT3.1蛋白的序列比对

图4  黄瓜、甜瓜和西瓜NRT3.2蛋白的序列比对

  2.2  黄瓜NRT3的顺式元件及功能预测
  基因上游序列中顺式调控元件的分析对揭示基因的功能具有重要意义。本研究通过对基因上游序列中顺式调控元件分析发现，在黄瓜NRT3基因的上游序列中存在多个逆境和激素应答顺式调控元件，但类型和数目并不相同（表2）。在Csa003832上游序列中分别存在一个病原物应答元件Box-W1，一个茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif，一个热胁迫应答元件HSE，一个水杨酸应答元件TCA-element，一个防卫应答元件W box，以及三个逆境和防卫响应元件TC-rich repeats；Csa003716含有两个脱落酸应答元件ABRE，一个赤霉素应答元件GARE-motif，一个热胁迫应答元件HSE，一个干旱胁迫应答元件MBS，以及一个逆境和防卫响应元件TC-rich repeats。这说明2个NRT3基因对激素和逆境应答方面存在一定差异，且不仅对非生物逆境胁迫应答，可能对生物胁迫也具有一定的应答功能。进一步分析与黄瓜NRT3亲缘关系较近的甜瓜NRT3的顺式调控元件（表2），也发现CmNRT3.1、CmNRT3.2上游序列中存在多个应答激素和逆境的顺式调控元件，且分别与其直系同源基因Csa003832和Csa003716含有的顺式调控元件的种类和数目存在一定差异。根据顺式调控元件分析和进化分析的结果，推测黄瓜NTR3基因在调控NRT2对氮素吸收、转运，非生物及生物逆境胁迫应答中具有一定功能。此外，Csa003832还参与茉莉酸甲酯、水杨酸、热胁迫信号应答及病原物胁迫和防卫应答，而Csa003716在脱落酸、赤霉素、热胁迫及干旱胁迫信号应答中具有一定功能。至于实际情况如何，需要进一步实验验证。

  注：ABRE，脱落酸应答元件；Box-W1，病原物应答元件；CGTCA-motif，茉莉酸甲酯应答元件； GARE-motif，赤霉素应答元件；HSE，热胁迫应答元件；MBS，干旱胁迫应答元件； TC-rich repeats，逆境和防卫响应元件；TCA-element，水杨酸应答元件；W box，防卫应答元件。-代表没有。
  3  讨论与结论
  本研究利用生物信息学方法首次从黄瓜基因组中鉴定出两个NRT3基因Csa003832和Csa003716。分析发现它们均位于黄瓜1号染色体上，分别具有2个和1个外显子，且分别与拟南芥的NRT3.1和NRT3.2、甜瓜的MELO3C002305T1和MELO3C002306T1、西瓜的Cla005121和Cla005122直系同源，黄瓜和甜瓜NRT3在进化上关系较近。蛋白序列比对表明，瓜类作物NRT3的序列比较保守。顺式调控元件分析发现，黄瓜2个NRT3基因上游顺式调控元件差异较大，而且与甜瓜相应直系同源基因在顺式调控元件类型和数目上也存在一定差异，说明它们对环境因素的应答可能有所不同。黄瓜的NRT3基因都具有数个植物激素和逆境应答元件，暗示它们不仅在调控NRT2基因氮素吸收过程中具有一定功能，而且与植物逆境应答有关。至于实际情况如何，需要进一步研究。本研究为进一步研究黄瓜NRT3的功能提供了线索。
  参考文献
[1] 段娜,章尧想,刘芳,等.植物氮素吸收及其转运蛋白研究进展[J].分子植物育种,2015,13(2):461-468.
[2] Anne Krapp, Laure C D, Camille Chardin, et al. Nitrate transport and signalling in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany, 2014,65(3):789-798.
[3] 马清,管超,夏曾润,等.高等植物氮素转运蛋白研究进展[J].兰州大学学报:自然科学版,2015,51(2):217-227.
[4] 张鹏,张然然,都韶婷.植物体对硝态氮的吸收转运机制研究进展[J].植物营养与肥料学报,2015,21(3):752-762.
[5] Okamoto M, Vidmar J J, Glass A D. Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana: responses to nitrate provision[J]. Plant Cell Physiol.2003,44(3):304-317.
[6] Plett D, Toubia J, Garnett T, et al. Dichotomy in the NRT gene families of dicots and grass species[J]. PLoS One, 2010, 5: e15289
[7] Yong Z, Kotur Z, Glass AD. Characterization of an intact two component high-affinity nitrate transporter from Arabidopsis roots [J]. Plant J. 2010, 63: 739-748. 
[8] Okamoto M ,Kumar A, Li W, et al. High-affinity nitrate transport in roots of Arabidopsis depends on expression of the NAR2-like gene AtNRT3.1[J].Plant Physiol.2006, 140(3):1036-1046.
[9] Kotur Z, Mackenzie N, Ramesh S, et al. Nitrate transport capacity of the Arabidopsis thaliana NRT2 family members and their interactions with AtNAR2.1. New Phytol, 2012,194:724-731.
[10] Dechorgnat J, Nguyen C T, Armengaud P, et al. From the soil to the seeds: the long journey of nitrate in plants. J Exp Bot,2010, 62:1349-1359.
[11] Chiu C C, Lin C S, Hsia A P, et al. Mutation of a nitrate transporter, AtNRT1:4, results in a reduced petiole nitrate content and altered leaf development. Plant Cell Physiol,2004, 45:1139-1148.
[12] Li J Y, Fu Y L, Pike S M, et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT1.8 functions in nitrate removal from the xylem sap and mediates cadmium tolerance. Plant Cell,2010,22:1633-1646.
[13] Wang Y Y, Tsay Y F. Arabidopsis nitrate transporter NRT1.9 is important in phloem nitrate transport. Plant Cell,2011,23:1945-1957.
[14] Zheng D, Han X, An Y I, et al. The nitrate transporter NRT2.1 functions in the ethylene response to nitrate deficiency in Arabidopsis [J].Plant Cell Environ.2013,36(7):1328-1337.
[15] Camañes G, Pastor V, Cerezo M, et al. A deletion in the nitrate high affinity transporter NRT2.1 alters metabolomic and transcriptomic responses to Pseudomonas syringae[J]. Plant Signal Behav. 2012,7(6):619-622.
[16] Kiba T, Feria-Bourrellier AB, Lafouge F, et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants[J].Plant Cell,2012, 24(1):245-258.
[17] Lezhneva L, Kiba T, Feria-Bourrellier AB, et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.5 plays a role in nitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants[J].Plant Journal, 2014, 80(2):230-241.
[18] Dechorgnat J, Patrit O, Krapp A, et al. Characterization of the Nrt2.6 gene in Arabidopsis thaliana: a link with plant response to biotic and abiotic stress[J].PLoS One,2012,7(8):e42491.
[19] Chopin F, Orsel M, Dorbe MF, et al. The Arabidopsis ATNRT2.7 nitrate transporter controls nitrate content in seeds[J].Plant Cell.2007,19(5):1590-1602.
[20] Leran S, Varala K, Boyer J. A unified nomenclature of NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER family members in plants[J]. Trends in plant science, 2014,19(1):5-9.
[21] 姚娟,李衍素,郭允娜,等.短期亚适宜温光对黄瓜氮吸收运转相关酶活性和基因表达的影响[J].园艺学报,2013,40(7):1289-1297.
[22] 秦智伟,冯卓,武涛,等.黄瓜硝酸盐转运蛋白基因CsNRT1.5的克隆及表达分析[J].东北农业大学学报,2013,44(7):80-84.
[23] Migocka M, Warzybok A, Kłobus G. The genomic organization and transcriptional pattern of genes encoding nitrate transporters 1 (NRT1) in cucumber[J]. Plant Soil, 2013,364:245-260.